自殺原虫による多機能ワクチンの開発研究

 

研究室 先端予防治療学研究分野
Research Unit for Advanced Preventive Medicine
事業推進担当者 杉本 千尋(Chihiro Sugimoto),河津信一郎(Shin-ichiro Kawazu),井上  昇(Noboru Inoue)
異動先(異動先ポジション) 杉本千尋, 北海道大学人獣共通感染症リサーチセンター

 

研究要旨

   

 細胞外寄生性原虫であるトリパノソーマを用いて作製 したプロトタイプの誘導致死変異原虫(自殺原虫ワクチ ン)を更に発展させ,細胞内寄生原虫ではトキソプラズ マを用いて自殺原虫を作製し,試験管内での致死誘導試 験,実験動物を用いた効果試験を行う。本研究の過程で 原虫ワクチンとしての応用のみならず,様々な宿主―原 虫相互作用(免疫応答・免疫回避・細胞侵入・細胞脱出 など)を解析する上でも優れた実験系として機能するこ とが期待される。また,簡便高感度な診断法の開発が世 界的な急務である熱帯原虫病について,LAMP 法を応用 した画期的診断法の開発を行う。    

   

多機能ワクチンの開発研究

 弱毒生ワクチン原虫株の安全性を向上する目的で,ワ クチン原虫を遺伝子改変し,致死遺伝子発現あるいは必 須遺伝子のRNA 干渉を誘導的に制御できるようにする。 得られたワクチン原虫は免疫誘導時には通常の生ワクチ ンとして効果的な防御免疫を確立し,免疫誘導後は致死 遺伝子またはRNA 干渉の誘導によって完全に宿主動物 体内から排除することができる。
  本研究計画でははじめに,トキソプラズマの宿主細胞 侵入に必須であるTgMIC2をテトラサイクリン誘導性 に過剰発現するトキソプラズマを作出し,その細胞侵入 能および病原性を精査した。その結果,TgMIC2過剰発 現トキソプラズマは細胞侵入能および病原性が低下し, 弱毒化されていることが明らかとなった。弱毒化は TgMIC2の翻訳後修飾あるいは細胞内ソーティングの以 上によると考えられた。成果は国際学術誌に投稿中であ る。トキソプラズマに対する誘導的RNA 干渉ベクター の構築に関しては,すでに構築が完了した非誘導的 RNA 干渉ベクターにテトラサイクリンオペレーターを 導入し,誘導的RNA 干渉ベクターへと改良する予定で あったが,組替えプラスミドを得ることができなかった ため,期間内に終了できなかった。研究を担当したポス ドク研究員は現在タイ国マヒドン大学に常勤の職を得, 感染症に関する応用研究を行っている。

LAMP 法を用いた原虫病迅速簡 便診断法開発

 Loop-mediated isothermal gene amplification 法 (LAMP 法)は等温反応で高感度かつ特異的に標的遺伝 子を増幅する方法である。検出感度はPCR 法と同程度 だが,高価な反応装置を必要とせず,1時間以内に反応 が終了することから病原体検出への応用が期待されてい る。現在熱帯原虫病流行地では顕微鏡検査などの安価で はあるが感度や正確度に問題のある診断技術が主として 利用されている。PCR 法は高感度かつ正確な原虫病診 断法として有望であるが,複雑な反応系と高価な反応装 置が必要であるため開発途上国などではほとんど利用さ れていない。そこで我々の研究グループでは反応がシン プルで高価な装置も必要が無いLAMP 法を熱帯原虫病 の診断手法として確立するべく,海外研究協力者と共同 で開発研究を実施した。これらの成果の一部は国際学術 誌に報告ずみである。特にLAMP 法を用いたアフリカ トリパノソーマ検出法の開発に関しては良好な成績が得 られたので,米国NIH グラント申請(2007年申請中), スイスに拠点を置く熱帯病(結核,アフリカトリパノソ ーマ,マラリア)診断法開発財団,Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND) 研究プロジェクト申 請(2007年採択),OIE リファレンスラボ申請(2007年 採択・トリパノソーマ診断に関する責任者は井上)など の国際共同研究に発展した。今後もLAMP 法を用いた 熱帯原虫病診断法開発国際拠点として我々の研究グルー プが主導的役割を担っていくことが期待できる。

発表論文

著者名
論文タイトル
掲載雑誌
ページ
発行年
Namangala, B., Inoue, N. and Sugimoto, C. Effects of exogenous transforming growth factor-beta on Trypanosoma congolense infection in mice Infection and Immunity 印刷中
2007
Thekisoe, O. M. M., Inoue, N., Kuboki, N., Tuntasuvan, D., Bunnoy, W., Borisutsuwan, S., Igarashi, I. and Sugimoto, C. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification (LAMP), PCR and parasitological tests for detection of Trypanosoma evansi in experimentally infected pigs Veterinary Parasitology 130 327-330 2005
Witola, W. H., Inoue, N., Ohashi, K. and Onuma, M. RNA-interference silencing of the adenosine transporter-1 gene in Trypanosoma evansi confers resistance to diminazene aceturate Experimental Parasitology 107 47-57 2004
Kumar, S., Yokoyama, N., Kim, J. Y., Huang, X., Inoue, N., Xuan, X., Igarashi, I. and Sugimoto, C. Expression of Babesia equi EMA-1 and EMA-2 during merozoite developmental stages in erythrocytic membrane skeleton Molecular and Biochemical Parasitology 133 221-227 2004
Kuboki, N., Inoue, N., Sakurai, T., Di Cello, F., Grab, D. J., Suzuki, H., Sugimoto, C. and Igarashi, I. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) and its application for the detection of African trypanosomes Journal of Clinical Microbiology 41 5517-5524 2003
細胞骨格遺伝子の発現抑制による自殺型原虫の作製
図1
細胞骨格タンパク質の一つであるチュブリンのmRNAををRNA干渉法によってノックダウンし、自滅させたトリパノソーマ原虫の形態変化。正常型(A)、正常型(B左)と自滅型(B右)、自滅型(C,D,E)
LAMP法によるトリパノソーマ感染の高感度検出
図2
トリパノソーマ感染後30日間、1日毎に感染マウスから血液を採取し、顕微鏡検査(図上段・Buffy Coat)、LAMP法(図中段)、およびPCR法(図下段・PCR2)の検出感度を比較した結果、LAMP法が最も検出感度が高かった。