原虫病制圧を目的としたベクターコントロールシステムの開発

 

代表研究者:藤崎幸蔵

研究課題の背景・目的

 多くの原虫病は節足動物によって媒介されるため,ベクターコントロールは原虫病制圧の有力な戦略となりうる。とくにマダニは,我が国を含む世界各地で家畜に甚大な被害を与えているBabesia症 などの原虫病だけでなく,ウイルス,リケッチア,細菌,寄生虫などの多種多様な疾病を媒介することから,その防圧はすべてのマダニ媒介性疾病の制圧にとっ て極めて重要であると考えられる。しかし,殺ダニ剤を主体とする現行のマダニコントロールは,マダニによる薬剤抵抗性獲得や,薬物残留による環境・乳肉汚 染などの様々な問題が顕在化しており,有効性と安全性に優れた防除技術を早急に開発する必要がある。このため,本COEプロジェクトでは安全性,有効性,経済性に優れた新たなマダニコントロール手段として,抗マダニワクチン,バイオ殺ダニ剤,原虫媒介阻止ワクチンなどを開発することを目的とした研究課題を設定し,問題の解決にあたることにした。

研究課題の概要

 本課題は,第1の研究骨子として,(1)マダニの生存に重要な役割と機能を発揮する物質(マダニ生物活性分子tick bioactive-molecules:TBMと総称)の探索とその特性の分子・遺伝子学的な解明を行うとともに,(2)ワクチン候補物質としての可能性を検証し,(3)ワクチンとしての有効性が示されたTBMの遺伝子は,ヘルペスウイルスに導入し抗マダニウイルスベクター組換えワクチンとして,免疫学的マダニ防除の目的に活用することを内容とする。また,第2の骨子としては,(1)TBMの特性解明の過程で組換え蛋白作成目的に利用したAcNPVなどのバキュロウイルス組換え体について,殺ダニ活性を検証し,(2)そ のバイオ殺ダニ剤としての可能性を追求することを研究内容とする。そして,これらの成果に立脚し,化学的殺ダニ剤に極力依拠する必要のない,抗マダニワク チンとバイオ殺ダニ剤の併用という世界に類を見ない新規かつ実用的なマダニコントロールの実現を図ることを,研究の最終目的とするものである。

   
Babesia gibsoniの媒介者の クリイロコイタマダニ Rhipicephalus sanguineus フタトゲチマダニの 唾液腺胞内で増殖した 組換え体バキュロウイルス(AcNPV・CHT1)の蛍光

得られた成果

1.ダニのTBMの探索とその特性解明:我が国を始め環太平洋地域における人獣の原虫病の媒介者として最も重要なフタトゲチマダニHaemaphysalis longicornisのTBMについて,遺伝子クローニングを実施し,これまでにperoxiredoxin(主要発現部位は唾液腺),troponin I(筋肉),chitinase(クチクラ)の特性解明を終えた。また,アフリカ東部などの,食料不足に悩む世界の半乾燥地域における畜産振興の障害になっているマダニであるOrnithodoros moubataからは,マダニの異物認識機構に関わるgalectin(主要発現部位はヘモリンフ)を発見した。これらのTBMについてはすべて特許申請(一部は国際特許)した。

2.組換え体の殺ダニ活性:chitinaseの組換え蛋白作成目的に利用したバキュロウイルス組換え体(AcNPV・CHT1)が,野生型ウイルスにはないフタトゲチマダニにおける感染・増殖性を有することを明らかにした。また,体表面滴下(topical application)されたAcNPV・CHT1は,マダニ体内で増殖することによって数日以内にマダニを斃死させたことから,バイオダニ剤として利用できる可能性を有すると考えられた。

3.バイオ殺ダニ剤としての可能性:AcNPV・CHT1は,30℃以上の温度や紫外線に曝すことで殺ダニ活性が失活し,また昆虫培養細胞では感染増殖するが,ほ乳類細胞では増殖できないことを明らかにした。これらの知見は,AcNPV・CHT1が安全性の高いバイオ殺ダニ剤として実用化を図るに値することを示唆すると,考えられた。

今後の展望

 現段階で本研究に残されている課題は,(1)キチナーゼ以外にこれまで探索中のおよそ5つのTBMについて特性を早急に明らかにし,(2)ワクチン候補物質としての可能性を検証後,(3)CHT1とともに遺伝子をヘルペスウイルスに導入し,抗マダニウイルスベクター組換えワクチンとしての有用性を確認することである。また,(4)CHT組換えAcNPVについては,(5)より具体的にバイオ殺ダニ剤としての可能性を追求することが課題として残されている。(6)検索中のTBMの中には抗原虫作用が疑われるものがあり,新規殺原虫物質としての性状の特定を急ぐ必要がある。(7)また,原虫病は媒介しないが世界的に家畜の生産性に甚大な被害を与えているウシバエなどの寄生虫のコントロールにも有用と考えられるTBMも発見されていることから,今後,ベクターコントロールシステムの研究対象としたマダニ以外の寄生虫についても,マダニで得られた研究成果をフィードバックし,そのコントロールシステムの樹立に役立てる必要がある。

Development of a novel vector-eradication system for the control of protozoan diseases

The objective of this research is to develop biological tick control systems that do not pose environmental and health risks associated with chemical residues and can be used as an attractive alternative to chemical pesticides. One approach to enhance the tickcidal properties of naturally occurring microorganisms is to insert into them genes that encode for enzymes, toxins, or hormones that have a direct or indirect effect on the development of the ticks. The outcome will be the production of new recombinant insect vectors. We were the first to demonstrate that the baculovirus Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) was a potential vector for the expression of a gene encoding chitinase, a tick bioactive molecule (TBM) from Haemaphysalis longicornis that is responsible for the degradation of chitin. We, therefore, expect to develop quantitative bioassays of the recombinant baculovirus expressing chitinase (AcMNPV・CHT1) and further evaluate the tickcidal effects of this new recombinant chitinase on larvae, nymphs, and adults of H. longicornis ticks.

AcMNPV・CHT1 expressing the chitinase enzyme could express the chitinase enzyme in both Spodoptera frugiperda (Sf9) and Trichoplusia ni (High five) insect cells. Topical application of the supernatant harvested from the insect culture systems was found to cause mortality in nymphs and adult ticks. High-temperature (>30°C) and ultraviolet radiation affected the chitinase enzyme activity and recombinant baculovirus infectivity by reducing the speed of tick killing (60 %). A mixture of recombinant virus and chitinase was found to kill ticks faster (p=0.01) than pure chitinase and recombinant virus alone. Thus, the recombinant virus showed a synergistic effect with the foreign gene chitinase. Recombinant baculovirus expressed a chitinase enzyme with a molecular mass of 116kDa in insect cells, but there was no expression in (RK13) mammalian cells. These findings are important for the safe use of the recombinant virus expressing chitinase as a bio-acaricide against ticks. To reduce the cost and minimize the time required for use of the acaricide, we found that a mixture of the recombinant virus and Flumethrin could be used in a dose equivalent to one half of that of the chemical acaricide.